Preparación de los medios de cultivo.
Ningún medio soportara el crecimiento de todos los tipos celulares. Los cambios en los medios de cultivo son a menudo necesarios para diferentes tipos de respuesta de un explante. Si no existe literatura sobre una planta en particular, el desarrollo de un medio adecuado depende de prueba/error. El desarrollo de medios dependerá en el propósito del cultivo celular.
Identifique el tipo de medio a preparar y asegúrese que todos los ingredientes sean añadidos al frasco de preparación. Mantenga registros de la fecha de preparación y el uso. Siempre utilice agua destilada. Coloque un volumen cercano a los 500 mL de agua en el frasco antes de añadir los ingredientes para evitar coprecipitaciones. Nunca vierta sobrante de soluciones stock a los recipientes originales. Limpie cualquier derrame ocurrido en el área de trabajo y balanzas.
Polvos empacados de MS se pueden comprar, eliminando la necesidad de preparar soluciones y medir ingredientes. Siga las instrucciones del fabricante.
Componente de los medios de cultivo.
En general un medio contiene:
- Sales inorgánicas
- Compuestos orgánicos
- Reguladores del crecimiento
- Vitaminas
- Carbohidratos
- Hexitoles
- Agentes gelificantes
- Aminoácidos
- Antibióticos
- Complejos naturales.
Sales inorgánicas.
La formulación de sales inorgánicas puede variar. La más ampliamente utilizada es la formulación de Murashige y Skoog (MS). Esta formulación se desarrollo para asegurar que ningún incremento del crecimiento celular in vitro se deba a la introducción de sales adicionales.
Algunas características esenciales de MS: elevado contenido de nitrato, potasio y amonio. Normalmente se tienen cinco soluciones stock de sales inorgánicas en MS, con una concentración 100X.
Las soluciones stock se guardan en refrigeración y son estables por varios meses. Prepare las soluciones con agua destilada o desmineralizada. Etiquete de manera clara las botellas. Utilice reactivos grado químico. Considere la estabilidad y coprecipitabilidad de los compuestos.
Los stock de nitratos suelen precipitar y formar cristales. Deben ser calentados para disolverlos nuevamente. Cualquier stock que aparezca “nublado” debe ser descartado.
Reguladores del crecimiento.
El tipo y concentración de los reguladores del crecimiento de plantas varían de acuerdo al propósito del cultivo celular.
Auxinas.
Una auxina (IAA, NAA, 2,4-D, o IBA) se requiere por la mayoría de los cultivos celulares para la división e iniciación del enraizado. A elevadas concentraciones, la auxina puede suprimir la morfogénesis. La auxina 2,4-D es ampliamente utilizada para la inducción de callos: IAA, IBA y NAA son utilizados para la inducción del enraizamiento.
Los stock de auxinas se preparan usualmente pesando 10 mg de auxina en un vaso de 200 mL, añadiendo algunas gotas de NaOH 1N o KOH, hasta que los cristales se disuelvan (no mas de 3 mL). Añadir rápidamente 90 mL de agua bidestilada e incrementando el volumen a 100 mL en un frasco volumétrico. Las Auxinas pueden también ser disueltas en etanol del 95% y diluidas al volumen, sin embargo, el etanol es toxico para los tejidos vegetales.
Las sales de K de una auxina son mas solubles en agua. Haga los stocks de IAA frescos semanalmente, IAA se degrada dentro de pocos días por la luz, y dentro de algunas horas a días por los tejidos de plantas. Las auxinas son termoestables a 110-120 °C por 1 h.
Citokinas.
Las citokinas (kinetina, BA, zeatina, y 2iP) promueven la división celular, proliferación de brotes, y morfogénesis. Por ejemplo, thidiazuron (TDZ; N-fenil-N´-1,2,3-tiadiazol-5-urea) tiene actividad de citokinina y es utilizada comercialmente como defoliante.
Los stocks se preparan de manera similar a las auxinas, excepto que se utiliza HCl 1N y unas pocas gotas de agua para disolver los cristales, junto con calentamiento. Adición de agua bidestilada se añade rápidamente en un frasco volumétrico. Los stocks se pueden guardar en refrigeración. Las citokinas (kinetina y zeatina) son termoestables 1h a 120 oC; 2iP y BA son estables por 20 minutos a 100 °C.
Gliberinas.
Las Giberelinas se utilizan en los cultivos celulares, inhiben el crecimiento de callos y la formación de raíces adventicias inducidas por auxina. Es útil en estudios de morfogénesis.
Las soluciones stock se preparan disolviendo los cristales en agua y ajustando el pH a 5,7, A pH alcalino el GA se convierte en formas biológicas inactivas. Las soluciones de GA no son termoestables y 20 min a 114 oC reducen su actividad más del 90%. Las soluciones frescas deben pasar por filtración estéril para añadirse.
Por ejemplo, el ácido abscísico (ABA), hormona involucrada en la abscisión y dormancia de hojas y frutos, es útil en cultivos de embriones. El ABA es termoestable pero sensible a la luz. La conversión parcial del isómero 2-cis de ABA al isómero 2-trans de menor actividad biológica ocurre en la luz. Las soluciones stock pueden ser preparadas en agua bidestilada.
Vitaminas.
Las vitaminas tienen función catalítica en las reacciones enzimáticas. Las vitaminas consideradas importantes para las células vegetales son: Tiamina (B1), ácido nicotínico (B3) y piridoxina (B6). Se añaden al medio de cultivo para incrementar la respuesta celular.
Los stocks de vitaminas se guardan mejor en un congelador. Se recomiendan alícuotas de 10 mL para verter en 1 L de medio preparado. Es preferible realizar filtración estéril antes que autoclavado.
- Stocks: 5 mg de ácido nicotínico y 5 mg piridoxina en 100 mL de agua.
- Stocks: 40 mg de tiamina en 1000 mL.
Carbohidratos.
Las células verdes en cultivo generalmente no son activamente fotosintéticas y requieren de una fuente de C.
- Sucrosa y glucosa del 2-5% (p/v).
- Fructuosa y almidón, también pueden utilizarse.
Menores niveles de carbohidratos se pueden utilizar en cultivos de protoplastos, y mayores niveles para cultivo de embriones y anteras. Los azúcares sufren caramelización si se autoclavan mucho tiempo, reaccionando con grupos amino (reacción de Maillard). Las melanoidinas formadas inhiben el crecimiento celular, entonces el medio debe ser descartado.
Hexitoles.
El mioinositol se ha encontrado ser importante en cultivos de tejidos. Está involucrado en la biosíntesis de ciclitol, almacenamiento de compuestos polihídricos como reservas, germinación de semillas, transporte de azúcar, nutrición mineral, metabolismo microbiano, estructura de membrana, formación de pared celular, homeostasis hormonal y fisiología del estrés.
El mioinositol se considera también como un potenciador del crecimiento in vitro, y puede utilizarse como fuente de carbohidrato, algunos lo consideran tiene una acción semejante a la vitamina. El manitol y sorbitol son hexitoles, útiles osmóticamente para el aislamiento de protoplastos.
Agente gelificante.
Muchos experimentos de cultivo son conducidos sobre soportes estacionarios, un agente gelificante es comúnmente utilizado. Algunos soportes incluyen: papel filtro, algodón, tela de lino, vermiculita, membranas especiales con medios líquidos. El tipo de agar también es importante pues afecta la respuesta de los experimentos.
Se debe trabajar con agar purificado. Gelrite es un polisacárido producido como producto de fermentación con Pseudomonas. Otras marcas TC agar, Difco-Bacto agar. El agar debe ser disuelto en agua, en un recipiente resistente al calor, posteriormente se caliente, preferiblemente con movimiento constante, hasta que no se observen partículas flotando.
Si va a derretir agar previamente elaborado, asegúrese de que éste se encuentre ocupando la mitad del volumen del frasco. Se puede derretir tanto en microondas como en autoclave. Se utilizan también biorreactores para el cultivo de tejidos, se necesita regular el pH y la temperatura.
Amioácidos.
Aminoácidos y aminas son muy importantes en la morfogénesis. Todas las formas-L son naturalmente detectadas por las plantas. Como la L-tirosina contribuye a la iniciación de brotes, L-arginina facilita el enraizamiento, L-serina puede usarse en cultivos de microsporas para obtener embriones haploides. Y las aminas como la L-glutamina y L-asparagina, incrementan significativamente la embriogénesis somática.
Antibióticos.
Debido a inconvenientes de contaminación excesiva con algunos explantes, muchos trabajadores han incorporado fungicidas y bactericidas al medio de cultivo. En ocasiones estos pueden ser tóxicos para las plantas, y la contaminación puede reaparecer.
En experimentos de transformación utilizando Agrobacterium hacen necesario la incorporación de antibióticos al medio. Antibióticos comúnmente usados son: carbenicilina (500 mg/L), cefotaxima (300 ug/mL), augmentina (250 mg/L). Deben prepararse previo a la adición por filtración estéril al medio.
Complejos naturales.
Muchas adiciones a los medios nutritivos sirven para diferentes propósitos. Los antioxidantes para prevenir el color marrón de explantes: ácido cítrico, ácido ascórbico, pirogalol, floroglucinol. Los absorbentes para prevenir la decoloración de explantes: polivinilpirrolidona (PVP) y carbón activado (0,1 – 0,3%). Se utiliza carbón activado y neutralizado. El carbón activado puede inhibir compuestos y reducir metabolitos tóxicos, exudación y acumulación fenólica.
Complejos naturales pueden utilizarse como alternativa cuando el medio falla. La adición de estos compuestos vuelven al medio indefinido, debido a las variaciones en concentración de los compuestos inhibitorios. Algunos ejemplos: endospermo de coco (10 – 20% v/v), extracto de levadura (50 – 5000 mg/L), extracto de malta (500 mg/L), jugo de tomate (30%), jugo de naranja (3 – 10%), banana (150 g/L), extracto de papa, hidrolizado de caseína (30 – 3000 mg/L), emulsión de pescado (1 cucharadita/L).
pH del medio.
El pH se ajusta generalmente entre 5,5 y 6. Si es bajo 5,5, el agar no gelificará apropiadamente, y sobre 6,0 el gel será muy firme. El pH del medio baja de 0,6 a 1,3 unidades luego del autoclavado.
Algunos cultivos de plantas provocan una baja en el pH debido a la producción de ácidos o el uso de nitrógeno. El pH también se ve afectado por las sales inorgánicas, carbohidratos, agente gelificante, carbón activado, método de almacenamiento.
Ajuste el pH con HCl 1.0 o 0,1 N, o con NaOH, utilizando un gotero mientras se agita el medio constantemente. Siempre ajuste el pH antes de añadir el agar.
